L’evoluzione dei marcatori genetici utilizzati in genetica forense ha seguito i progressi della tecnologia e delle conoscenze scientifiche, passando da tecniche rudimentali a metodi altamente sofisticati e specifici. Ecco una panoramica storica delle principali tappe:
1. Anni ’70: Gruppi Sanguigni e Proteine
- Gruppi sanguigni (AB0, Rh, MN): Prima dell’avvento dell’analisi del DNA, i marcatori biologici erano limitati al sangue e ad altre sostanze corporee. Le analisi si basavano sulla determinazione dei gruppi sanguigni e di altri antigeni.
- Enzimi e proteine sieriche: Venivano analizzati marcatori proteici, come le varianti dell’enzima PGM (fosfoglucomutasi) e delle globuline. Tuttavia, il potere discriminativo era basso e spesso insufficiente per identificazioni univoche.
2. Anni ’80: L’Avvento del DNA Fingerprinting
- 1985: Scoperta dei minisatelliti (VNTR)
Alec Jeffreys scoprì i VNTR (Variable Number Tandem Repeats), regioni di DNA con ripetizioni lunghe e altamente variabili tra individui. Questa tecnica, nota come DNA fingerprinting, permetteva di identificare univocamente una persona tramite l’analisi di alcune regioni del genoma. Iniziava l’era dello studio dei marcatori genetici del DNA principalmente per due applicazioni:- Identificazione di individui e test di parentela. Richiedeva però grandi quantità di DNA e campioni non degradati.
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
Questa tecnica tagliava il DNA in frammenti mediante enzimi di restrizione, evidenziando variazioni genetiche. Pur essendo innovativa, era laboriosa e richiedeva DNA di buona qualità.
Corsa elettroforetica del marcatore VNTR D1S80 effettuata su gel di agarosio, evidenziazione con etidio bromuro.
Questo esame si utilizzava prevalentemente per le analisi di paternità, perchè i marcatori sono ereditati secondo una modalità mendeliana. Sul lato inferiore dell’immagine i frammenti più leggeri.
Legenda: 1 e 9: marcatore di peso molecolare; 4, 6 ladder di alleli noti del marker D1S80; 8 controllo negativo. 3 e 5 sono due fratelli (gemelli identici), 7 è la madre e 2 il padre presunto. 8 il controllo negativo.
Il confronto dimostra che l’uomo esaminato non corrisponde a quello biologico. Ma voi lo avevate già capito, vero?
Qui sotto alcune immagini di analisi VNTR su gel di agarosio, colorazione bromuro di etidio.
3. Anni ’90: STR e PCR
- STR (Short Tandem Repeats)
Negli anni ’90 i minisatelliti vennero sostituiti dagli STR, ripetizioni più corte (2-6 paia di basi) che richiedevano meno DNA e avevano un potere discriminativo elevato.- Vantaggi: Applicabili anche a campioni degradati o in piccole quantità.
- Esempi: Marker come D3S1358, D8S1179, D21S11.
Qui sotto alcuni esempi di analisi STR su poliacrilamide verticale denaturante (PAGE) e colorazione in nitrato d’argento.
PCR (Polymerase Chain Reaction)
La PCR rivoluzionò la genetica forense, permettendo di amplificare piccole quantità di DNA in laboratorio, rendendo possibile l’analisi di campioni deteriorati o minimi.
- Marcatori Y-STR: STR presenti sul cromosoma Y, usati per identificare linee maschili in campioni misti.
- Marcatori mtDNA: DNA mitocondriale, utile per identificare resti degradati grazie alla sua eredità materna e alla resistenza alla degradazione.
Con gli STR, anche esaminati in multiplex, si potevano affrontare anche test di paternità. Le forme alleliche erano numerose e l’individuazione degli alleli relativamente semplice. Richiedeva tuttavia molto tempo per ottenere i risultati.
Gel di poliacrilamide di un STR (FES-FPS). Dopo la colorazione con nitrato d’argento e il confronto con il ladder ciascuan forma allelica è facilmente identificabile. Tuttavia, in presenza di interalleli (freccia) l’interpretazione non è così semplice e richiedeva una buona dose d’esperienza soggettiva dell’operatore.
4. Anni 2000: SNP e Nuove Tecnologie
- SNP (Single Nucleotide Polymorphism)
Gli SNP sono variazioni di singoli nucleotidi nel genoma. Sebbene meno variabili degli STR, sono estremamente numerosi nel genoma umano e possono essere analizzati in quantità elevate.- Vantaggi: Richiedono pochissimo DNA e sono utili per campioni estremamente degradati.
- Applicazioni: Fenotipizzazione e studio della biogeografia.
Gli SNP venivano in realtà usati per la tipizzazione con le prime applicazioni della PCR a uso forense. Il metodo usato per rilevare gli alleli consisteva in sistemi dot-blot con rilevazione su strip.
Database di DNA
L’uso di marcatori genetici è stato amplificato dalla creazione di banche dati nazionali e internazionali, consentendo confronti rapidi tra profili genetici.
5. Anni 2010: Next Generation Sequencing (NGS)
- La NGS ha permesso di analizzare simultaneamente migliaia di marcatori genetici in una sola analisi, rivoluzionando la velocità e la portata dell’analisi del DNA.
- Applicazioni:
- Fenotipizzazione forense: Previsione di caratteristiche fisiche come colore degli occhi, capelli e pelle.
- Origine geografica: Identificazione dell’ascendenza genetica di un individuo.
- Campioni misti: Separazione e analisi di DNA proveniente da più individui.
- Applicazioni:
Ci sono alcune compagnie (poche) che vendono pannelli già pronti per analisi di molti marcatori che rispondono a diverse domande degli investigatori (V. per es. Verogen).
6. Presente e Futuro: Tecnologie Avanzate
- Epigenetica forense
Analisi delle modifiche chimiche del DNA (es. metilazione) per determinare l’età o lo stato di salute di un individuo. - DNA ambientale (eDNA)
Analisi di tracce genetiche presenti nell’ambiente, come aria o acqua, per ricostruire scene del crimine o identificare individui. - Machine Learning
Utilizzo di algoritmi per interpretare dati genetici complessi e migliorare la precisione delle analisi.
L’evoluzione dei marcatori in genetica forense ha ampliato notevolmente le capacità di identificazione e analisi, passando da metodi rudimentali basati su proteine a tecniche avanzate come la NGS. Questa evoluzione continua a ridefinire il campo della genetica forense, rendendo le analisi sempre più accurate, veloci e applicabili a una vasta gamma di scenari.