Un metodo d’analisi è un documento scritto che descrive il procedimento analitico per determinare un saggio biologico, chimico o tecnico-farmaceutico. Per essere utilizzato, il metodo deve essere validato. Questo significa che deve dimostrare di essere idoneo allo scopo previsto attraverso la verifica di specifici parametri.
Nelle analisi del DNA ogni laboratorio deve descrivere come lavora su campioni e reperti.
Ricordiamoci che avere un protocollo analitico ben descritto assicura la validità dei risultati.
Non è sufficiente, infatti, “il buon senso” quando si ha da effettuare una delicata indagine di genetica forense.
Quasi sempre il report analitico fornirà elementi di prova che spesso porteranno a decisioni drammatiche sulla vita di una persona. Quindi è un dovere operare nelle condizioni migliori.
Questa condizione vale ovviamente per tutti i laboratori che operino secondo la norma ISO17025:2017. Ovviamente essa è applicabile anche per quelli non accreditati. E’ una good practice minima che migliora la performance.
La Validazione del Metodo
E’ un processo fondamentale per dimostrare che un metodo analitico è adatto allo scopo previsto. Si tratta di una procedura necessaria per garantire che il metodo fornisca risultati affidabili, accurati e riproducibili.
Obiettivi della Validazione
Ma perchè questa fase è così importante? L’utilità è quella di assicurare la validità dei risultati e può essere esplicitato più nel dettaglio, perchè serve a:
- Assicurare l’affidabilità e la riproducibilità dei risultati.
- Dimostrare che il metodo è idoneo per l’analisi di specifici campioni.
- Ridurre il rischio di errori nei test analitici.
- Soddisfare i requisiti normativi e di accreditamento (es., appunto, la ISO/IEC 17025).
Parametri della Validazione
I principali parametri analitici qui indicati si riferiscono soprattutto alle analisi chimiche.
In questo caso, essi sono valutati costantemente nella costruzione di un metodo. Ciò non toglie tuttavia che siano applicabili anche nel campo biologico, specialmente nelle analisi di genetica forense. Ciascuna fase analitica dovrebbe essere analizzata cercando di verificarne l’efficacia.
Lo abbiamo fatto recentemente, per esempio, per la fase di quantificazione. Un articolo che potrete leggere liberamente che ha ricevuto circa 2000 visualizzazioni in pochissimo tempo. A dimostrazione della grande attenzione riposta nell’accuratezza con cui sono valutate le varie fasi di un protocollo.
Ugo Ricci, et al. Looking into the Quantification of Forensic Samples with Real-Time PCR. Genes (Basel) 2024 Jun 9;15(6):759 doi: 10.3390/genes15060759.
- Linearità: verifica che la risposta del metodo sia proporzionale alla concentrazione dell’analita nel campione.
- Accuratezza: misura della vicinanza tra il valore sperimentale ottenuto e quello teorico atteso.
- Precisione. E’ la misura della riproducibilità dei risultati e viene suddivisa in:
- Ripetibilità: analisi condotta nel medesimo laboratorio alle stesse condizioni.
- Precisione intermedia: variazioni di analisti, giorni e strumenti all’interno dello stesso laboratorio.
- Riproducibilità: confronti tra diversi laboratori.
- Specificità. Rappresenta la capacità del metodo di individuare l’analita senza interferenze da altre sostanze presenti nel campione. Quando si effettua un’estrazione da una matrice biologica tutte le componenti genetiche (p.es. batteriche) vengono coestratte e si trovano insieme nell’eluato finale.
- Limite di rivelazione (LOD). Si definisce così la più piccola quantità di analita che può essere rilevata, ma non quantificata, con precisione.
- Limite di quantificazione (LOQ). E’ la più piccola quantità di analita che può essere quantificata con accuratezza e precisione. Nel caso del DNA si tratta, dunque, di quella minima quantità che consente di procedere all’amplificazione dell’estratto.
- Robustezza. Si tratta della capacità del metodo di mantenere la sua efficacia, seppure in presenza di piccole variazioni nei parametri analitici. Una caratteristica particolarmente importante quando le analisi debbono offrire risposte solide da portare in dibattimento.
Processo di Validazione
Dunque, sempre con lo scopo di chiarire ancora meglio, il processo di validazione può essere ulteriormente scomposto in più fasi:
- Pianificazione: si tratta della definizione degli obiettivi, scelta dei parametri da testare e redazione di un protocollo di validazione.
- Esecuzione degli esperimenti: è la fase analitica nella quale di acquisiscono le informazioni
- Analisi statistica: valutazione dei dati per verificare la conformità agli standard richiesti.
- Redazione del rapporto di validazione: documentazione dettagliata del processo, inclusi risultati, conclusioni e eventuali limitazioni del metodo.
- Implementazione e monitoraggio: utilizzo del metodo validato e verifica periodica delle prestazioni attraverso controlli di qualità.
La validazione di un metodo è dunque essenziale per garantire la qualità dei risultati analitici e per rispondere ai requisiti normativi e scientifici richiesti in diversi settori, tra cui il forense, il farmaceutico e l’ambientale.
Per il DNA ci sono molte indicazioni sul sito dell’ENFSI.
La messa a punto di un metodo di lavoro richiede la stesura del protocollo di analisi con la determinazione di tutti i parametri che influenzano i risultati. La strategia sviluppata per la prova di genetica forense a Careggi si può leggere qui.
Seguire le indicazioni nella costruizione di un metodo di prova solido vuol dire soddisfare a una delle indicazioni della Vision 2030 nell”area delle Scienze Forensi.
